SN 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T1223—2003 琼脂 绵羊进行性肺炎抗体检测方法 免疫扩散试验 The detection of antibodies against ovine progressive pneumonia virusProtocol of agar gel immuno-diffusion test 2003-05-28发布 2003-12-01实施 中华人民共和国 发布 国家质量监督检验检疫总局 中华人民共和国出人境检验检疫 行业标准 绵羊进行性肺炎抗体检测方法 琼脂 免疫扩散试验 SN/T1223—2003 * 中国标准出版社出版 北京复兴门外三里河北街16号 邮政编码：100045 电话：6852394668517548 中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷 开本880×1230 1/16 印张1/2 字数11千字 2003年9月第一版 2003年9月第一次印刷 印数12000 * 书号：155066·2-15297 网址www.bzcbs.com 版权专有 侵权必究 举报电话：（010)68533533 SN/T 1223—2003 前言 本标准的附录A是规范性附录。 本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本标准起草单位：中华人民共和国深圳出入境检验检疫局。 本标准主要起草人：黄运生、李永学、罗卫、石迎新。 SN/T1223—2003 绵羊进行性肺炎（OvineProgressivePneumonia，OPP）或绵羊梅迪-维斯纳病（Maedi-ViGBaDis- ease，MVD)是由MV/OPP病毒引起的绵羊的一种持续性病毒感染，其特征为病程缓慢、进行性消瘦和 呼吸困难，多表现间质性肺炎和脑脊髓炎症状。感染动物是主要传染源，目前已知仅有绵羊和山羊对本 病易感，而且绵羊和山羊之间有交叉感染性。 本病主要通过初乳传给新生羔羊，通过呼吸道水平传播， 才出现临床症状，继之呈进行性临床经过。感染动物可终身带毒，多数羊可出现临床症状和病变。在 MV/OPP病毒感染中，中和抗体没有阻止病毒在血液中传播的作用。目前该病在饲养绵羊的多数国家 已确定存在。MV/OPP临床和亚临床症状为在肺、乳房、中枢神经系统表现进行性单核细胞炎性病灶 和硬结性乳腺炎。MV/OPP对绵羊的繁育和改良及绵羊的贸易造成了严重的影响，所造成的经济损失 不能低估，该病已被国际兽疫局(OIE)列人B类疾病和我国农业部公布的二类传染病。由于多数感染 病毒的绵羊和山羊呈现无症状，但能持续带毒并且通过初乳或哺乳、其至通过呼吸道分泌物传播病毒， 因此通过建立快速可靠的诊断方法来检疫该病是控制该病的重要手段。 SN/T1223—2003 绵羊进行性肺炎抗体检测方法琼脂 免疫扩散试验 1范围 本标准规定了绵羊进行性肺炎（梅迪维斯纳病）抗体检测的操作方法和步骤。 流行病学调查。 2原理 琼脂是一种含有硫酸基的多糖体，形成凝胶后呈多孔结构，孔径的大小取决于琼脂浓度。抗原和抗 力很小，基本上呈自由扩散形式。由于不同抗原分子的分子量、结构、形状和电荷量不同，因此其扩散系 数不同，在凝胶中的扩散速度也就不同。当抗原与相应抗体经扩散后在凝胶中相遇，形成抗原抗体复合 物。若两者在相遇处比例适当，则形成最大的复合物。由于复合物的分子量增大，颗粒增大，因而不再 继续扩散而产生沉淀，呈现出线状或带状的“特异性屏障”，称为免疫沉淀线或免疫沉淀带，因此，可根据 抗原与标准阳性血清之间出现的这种沉淀线或沉淀带和抗原与被检血清之间是否出现沉淀线或沉淀带 来判定被检血清中是否存在抗体。 MV/OPP病毒最重要的抗原有两种，一种是病毒的囊膜糖蛋白，通常称为gP135；另一种为核心蛋 白P28，制备这两种蛋白时收取感染细胞的培养液，经聚乙二醇透析浓缩50倍左右后获得的一种抗原 制剂。以此抗原检测MV/OPP病毒抗体，特异性强，重复性好。从理论上讲，这两种抗原蛋白与其相 应的阳性血清应该成两条沉淀线，但试验结果证明，几乎所有的被检阳性血清只形成一条明显的沉 淀线。 3材料准备 3.1试剂：琼脂糖、氯化钠、叠氮钠、Tris碱、盐酸。 3.2MV/OPP琼脂扩散试验抗原、标准阳性血清：由OIE参考实验室或国家有关部门指定生产厂家 或指定实验室提供，按说明书使用。 3.3被检绵羊血清：按常规方法采血，分离血清，56℃水浴灭能30min。血清应无溶血、无细菌污染， 保存于4℃。 3.4器材：天平、吸管、量筒、平皿（规格为90.0mmX15.0mm）、三角瓶、外径为5.3mm的七孔梅花 样金属打孔器、微量移液器和微量吸头、观察灯、水浴锅、高压灭菌锅等。 4操作方法和步骤 4.11%琼脂板的制备。 4.1.1Tris-HCl缓冲液的配制：见附录A。 4.1.21%琼脂的制备：取Tris-HCI缓冲液100mL加人琼脂糖1.00g，氯化钠8.50g，加热充分溶 解，加0.01%叠氮钠，分装人试管，每管16mL备用。 4.1.3制板：将试管内琼脂加热融化，待琼脂溶液自然冷却至约56℃时，将直径为90mm洁净灭菌的 平血置于平台上，每个平皿加琼脂溶液16mL，使凝胶厚度达2.8mm。加盖待自然冷却凝固，把平血倒 SN/T1223—2003 置湿盒中，4℃冰箱密封备用。 4.1.4打孔：反应孔现用现打。从冰箱中取出琼脂板，立即按7孔一组（见图1）的梅花圆形打孔（中间 1孔，周围6孔），或按25孔一组（见图2)的矩形打孔（中间行9孔，上下2行各为8孔），孔径5.0mm， 孔距3.0mm。将孔中的琼脂轻轻挑出或吸出，勿伤边缘及使琼脂层脱离玻片，以免渗漏，可将打孔后 琼脂板底部经酒精灯火焰上方快速来回5次～7次加热封底。制好孔型的平皿写上日期及编号 图 1 图2 4.2加样：使用图1时，用微量移液器吸取抗原悬液滴入中间孔；使用图2时，G孔加抗原。+孔加标 准阳性血清，其他标有1、2、3..数字的孔分别加入被检血清，每孔加35μL～50μL，每孔均加满不溢 出为度。每加一个样品应换一个滴头。 4.3反应：加样完毕后，静止10min，将平皿倒置，放入湿盒于室温（22℃～25℃）中孵育，24h初判， 48h终判。 5结果判定 5.1判定方法 将琼脂板置暗视野下观察，抗原孔与标准阳性血清孔之间出现一条清晰致密的白色沉淀线，则试验 可以成立，否则视为无效，要更换试剂做重复试验。 5.2判定标准 5.2.1若抗原孔与被检血清孔间出现清晰致密沉淀线，并与标准阳性血清的沉淀线末端相连接，位置 微向内侧弯曲时，则被检血清判为阳性（见图3）。 图3 位置微向内侧弯曲者，则被检血清判为疑似反应。对该份血清应复检，仍为疑似则判为阳性反应（见 图4)。 图4 2 SN/T1223—2003 5.2.3若抗原孔与被检血清孔之间不出现任何沉淀线，且抗原孔与标准阳性血清孔间沉淀线直向被检 血清孔或向其外侧偏弯者，则被检血清判为阴性（见图5）， 图5 5.2.4若抗原孔、被检血清孔之间的沉淀线与抗原孔、标准阳性血清孔之间的沉淀线交叉，则判为非特 异性反应，应重做。若仍出现非特异性反应则判为阴性（见图6）。 图6 6注意事项 6.1加样时将孔加满为宜，切忌样品溢出。若溢出样品流人邻近孔时应重做。 6.2所有样品加样完毕后，样品应暂放4℃冰箱内保存，待判定结果后如无复检必要时再废弃。 6.3标准阳性血清避免反复冻融，以免降低效价影响检出效果。