ICS 65.120 B 46 DB34 安 徽 省 地 方 标 准 DB 34/T 2241—2014 畜禽饲料中伏马菌素 B1 的测定 —酶联免疫吸附法 Determination of fumonisin B1 in animal foodstuff—Enzyme linked immunosorbent assay 文稿版次选择 2014 - 12 - 17 发布 安徽省质量技术监督局 2015 - 01 - 17 实施 发 布 DB34/T 2241—2014 前 言 本标准按照 GB/T 1.1-2009 给出的规则起草。 本标准有安徽农业大学提出。 本标准起草单位：安徽农业大学、和县畜牧兽医局、马鞍山市农业委员会。 本标准起草人：王希春、伋兆法、吴金节、夏效平、陈祥国、李复辉、樊海新、李玉、冯士彬、李 贺侠、张宁。 I DB34/T 2241—2014 畜禽饲料中伏马菌素 B1 的测定-酶联免疫吸附法 1 范围 本标准规定了畜禽饲料中伏马菌素B1 的酶联免疫吸附法测定的术语和定义、原理、设备、试剂、检 测步骤。 本方法适用于饲料原料或配合饲料中伏马菌素B1 的测定。 本方法的最低检测限为 10 µg/kg。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB/T 14699.1 饲料 采样 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 伏马菌素 B1 fumonisin B1，FB1 伏马菌素B1 是主要由串珠镰刀菌代谢产生的一种真菌毒素。 4 原理 待检样品中的抗原和一定量的酶标抗原竞争与固相抗体结合，如待检样品中无抗原，则酶标抗原能 顺利的与固相抗体结合。如待检样品中含有抗原，则与酶标抗原以同样的机会与固相抗体结合。待检样 品中抗原含量愈多，结合在固相抗体上的酶标抗原愈少，则其最后加入酶底物后显色也愈浅。颜色的深 浅与待检样品中抗原含量成反线性相关。 5 5.1 5.2 5.3 5.4 5.5 5.6 设备 粉碎机（DYF-500） 分析天平（精确到 0.001 g） 涡旋混匀器（SZ-1） 酶标仪（MK3，波长 450 nm） 酶标板（48 孔或 96 孔） 单道微量移液器（10 µL、100 µL、1000 µL） 1 DB34/T 2241—2014 5.7 多道微量移液器（300 µL） 6 试剂 6.1 本检测方法所用试剂，凡未指明规格者，均为分析纯，水为 GB/T 6682 规定的一级水。 6.2 乙腈-水：1:1（V:V） 6.3 包被抗原 FB1 6.4 FB1 单克隆抗体 6.5 HRP-羊抗小鼠 IgG 6.6 包被缓冲液：碳酸钠（Na2CO3）1.59 g，碳酸氢钠（NaHCO3）2.93 g，加水溶解，调 pH 至 9.6，定 容至 1000 mL。 6.7 洗涤液 PBST：磷酸二氢钾（KH2PO4）0.2 g，磷酸氢二钠（Na2HPO4 •12H2O）2.9 g，氯化钠（NaCl） 8 g，氯化钾（KCl）0.2 g，吐温-20 0.5 mL，加水溶解，调 pH 至 7.4，定容至 1000 mL。 6.8 封闭液：5％脱脂奶粉，称取 5 g 脱脂奶粉，加入洗涤液至 100 mL，保存于 4℃冰箱中。 6.9 FB1 标准贮备溶液：称取 1 mg FB1 标准品，用乙腈水配制成约 1 mg/mL FB1 贮备液。贮备液置于 4℃冰箱中避光保存。 6.10 FB1 标准溶液：精确吸取标定后的标准储备液，用乙腈水新鲜配制成 FB1 标准溶液，浓度分别为 2.5 ng/mL、5 ng/mL、10 ng/mL、50 ng/mL、100 ng/mL、250 ng/mL。 6.11 TMB 底物显色液 ——A 液：醋酸钠（C2H3O2Na）13.6 g，柠檬酸（C6H8O7•H2O）1.6 g，30％双氧水（H2O2）0.3 mL，加 水至 500 mL。 ——B 液：乙二胺四乙酸二钠（EDTA） 0.2 g，柠檬酸（C6H8O7•H2O）0.95 g，甘油（C3H8O3）50 mL， TMB 0.15 g，加水至 500 mL。 使用前，A 液和 B 液按 1:1 混合使用。 6.12 终止液：2 mol/L H2SO4 溶液。 7 检测步骤 7.1 样品 饲料原料或配合饲料。 7.2 试样制备 按 GB/T 14699.1 饲料采样方法取得试样 800 g，四分法缩减至 100 g，磨碎，并通过 0.90 mm 孔径分子筛。 7.3 毒素提取 7.3.1 称取 20 g 粉碎并通过 0.90 mm 孔径的分子筛的试样，置于 250 mL 具塞锥形瓶中，加入 100 mL 乙腈水溶液，振荡 30 min，静置后取上清，滤纸过滤。 7.3.2 分装滤液，-20℃保存待测。 7.4 检测 7.4.1 将抗原用包被液稀释至需要浓度，在 96 孔酶标板上加入 100 µL，4℃过夜。 2 DB34/T 2241—2014 7.4.2 酶标板用 PBST 洗涤 3 次，每次 3 min，拍干。 7.4.3 加入 100 µL 封闭液，37 ℃ 1 h。 7.4.4 PBST 洗涤 3 次，每次 3 min，拍干。 7.4.5 每孔分别加入不同浓度 FB1 标准品溶液、样品提取液 50 µL，抗体液 50 µL，空白对照孔加入 100 µL 抗体液，37℃，1 h。 7.4.6 PBST 洗涤 3 次，每次 3 min，拍干 7.4.7 加入 100 µL 酶标二抗，37℃，1 h。 7.4.8 PBST 洗涤 3 次，每次 3 min，拍干。 7.4.9 加入 100 µL A 液 B 液混合后底物溶液，37℃，1 h。 7.4.10 加入 50 µL 终止液，终止反应。 7.4.11 用酶标仪在 450 nm 处测定吸光度值。 7.5 结果处理 7.5.1 绘制标准曲线 以不同浓度 FB1 标准品浓度的对数为横坐标，以 B/B0 百分比为纵坐标（B 为各竞争标准品浓度测 得的 OD450 值，B0 为不含标准品时测得的 OD450 值）绘制标准曲线。 7.5.2 计算结果 所得实验数据按公式（1）计算： W  cVX M ...................................... (1) 式中： W —— 伏马菌素B1 的浓度，ng/g； c —— 酶标板上测得的 FB1 的浓度（根据标准曲线求得），ng/mL； V —— 样品提取液的体积，mL； X —— 样品提取液稀释倍数； M —— 样品质量，g； 计算结果表示到小数点后一位有效数字。 7.6 重复性 在相同条件下获得的两次独立测定结果的相对误差不大于 10％。 7.7 回收率 本方法的回收率为 83％～96％。 3 DB34/T 2241—2014 AA 附 录 A （资料性附录） 伏马菌素 B1 标准品的标准曲线 B/B0 % 伏马菌素B1 标准品的标准曲线见图A.1。 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 系列1 线性 (系列1) 0 0.5 1 1.5 2 2.5 y = -34.715x + 87.277 2 R = 0.9961 3 对数(标准品浓度，ng/mL) 图A.1 伏马菌素 B1 标准品的标准曲线图 _________________________________ 4