ICS 65.020.20 CCS B 39 唐 山 市 地 DB1302 方 标 准 DB1302/T 523-2020 平茹原生质体再生复壮技术规程 2020-12-28 发布 唐山市市场监督管理局 2021-01-10 实施 发布 DB1302/T 523-2020 前 言 本文件按照GB/T 1.1-2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草。 本文件由唐山市农业农村局提出并归口。 本文件起草单位：唐山师范学院。 本文件主要起草人：范永山、武秋颖、张运峰、张淑红、高凤菊、石洪凌、李艳梅、商艳朝、李蕊、 张春刚、倪玉杰、徐树杰、史晓贤、韩靖琳、刘海英。 I DB1302/T 523—2020 平茹原生质体再生复壮技术规程 1 范围 本文件规定了平菇原生质体再生复壮的术语和定义、人员和设备、出发菌株制备、再生复壮、再生 菌株筛选和稳定性检测。 本文件适用于平菇（Pleurotus ostreatus）原生质体再生复壮。白灵菇（Pleurotus ferulae）和杏鲍菇 （Pleurotus eryngii）等其它食用菌的原生质体再生复壮可参照执行。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本文件。不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本 文件。 GB/T 23189 平菇 NY/T 528 食用菌菌种生产技术规程 NY/T 2375 食用菌生产技术规范 LS/T 6132 粮油检验 储粮真菌的检测 孢子计数法 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 出发菌株 种性退化或缺失需要复壮的原始菌株。 3.2 原生质体 脱去细胞壁的植物、真菌或细菌细胞。 3.3 原生质体再生菌株 经过原生质体再生获得的遗传性状稳定的菌株。 3.4 原生质体再生复壮 从原生质体再生菌株群体中筛选出恢复或超过出发菌株原有优良性状的技术。 4 人员和设备 4.1 人员 熟悉基本微生物操作，充分掌握安全操作规范。 1 DB1302/T 523—2020 4.2 实验室 应符合BSL-1实验室的要求。GB 19489-2008中6.1给出了建设BSL-1实验室的条件。 4.3 设备 4.3.1 4.3.2 4.3.3 4.3.4 4.3.5 4.4 超净工作台：无菌风的纯度≤0.5个/皿 时(φ 90 mm培养平皿)，风速可调。 高压蒸汽灭菌器：温度控制在121℃±0.5℃。 恒温培养箱：温度控制在22℃~28℃。 光学显微镜：放大倍数100~400倍。 离心机：转速控制在2500 r/min。 试剂和培养基 4.4.1 稳渗剂：0.6 mol/L甘露醇，用无菌水配制；121℃±0.5℃高压蒸汽灭菌20 min。 4.4.2 细胞壁降解液：2.0%溶壁酶液，用稳渗剂配制，0.22 μm微孔滤膜过滤。现配现用。 4.4.3 PDA培养基：马铃薯200 g，葡萄糖20 g，琼脂15 g，水1000 mL。 4.4.4 原生质体固体再生培养基：蔗糖20 g，蛋白胨5 g，琼脂15 g，稳渗剂1000 mL；121℃±0.5℃高 压蒸汽灭菌20 min。 5 出发菌株制备 5.1 来源 来自种性退化的人工栽培平菇子实体或菌种。人工栽培平菇应符合 GB/T 23189 的规定，平菇菌种 应符合菌种质量要求。GB 19172 给出了菌种质量要求。 5.2 制备过程 将子实体组织或菌种菌丝接种至 PDA 培养基中，恒温培养箱中培养 7 d，产生大量生长旺盛的菌丝 即获得出发菌株。接种过程在超净工作台中进行，所用试验材料和器具需提前进行消毒或灭菌。获得出 发菌株后立即开始原生质体制备。 6 再生复壮 6.1 6.1.1 原生质体制备 制备过程 6.1.1.1 挑取出发菌株幼嫩菌丝球至 1.5 mL 离心管内，加入 1.0 mL 稳渗剂，2500 r/min 离心 10 min， 弃上清液，重复洗涤 3 次，滤纸吸干菌丝球表面多余液体，用天平称取菌丝湿重。 6.1.1.2 每 0.1 g 菌丝加入 1 mL 细胞壁降解液，混匀，在 35℃下水浴加热酶解 2.5 h。 6.1.1.3 用孔径 48 μm 的细胞筛过滤酶液，除去残留菌丝。 6.1.1.4 2500 r/min 离心 2 min，弃上清液，沉淀加入适量稳渗剂，重复洗涤 2 次，获得原生质体悬液。 6.1.2 观察和计数 利用光学显微镜观察原生质体悬液，按 LS/T 6132 的规定进行原生质体计数，计算原生质体悬液 的浓度（个每毫升）。 2 DB1302/T 523—2020 6.2 原生质体再生 取 0.5 mL 浓度为 1.0×105 ~1.0×107 个每毫升原生质体悬液均匀涂布在原生质体再生固体培养基 上，25℃恒温培养至长出单菌落。 6.3 再生菌株培养 将再生过程中产生的单菌落分别在 PDA 培养基上单独培养 2~3 代，选择各代培养时菌丝和菌落形 态均一致的单菌落作为再生菌株。再生菌株应单独编号保存，不能与其它再生菌株混杂。 7 再生菌株筛选 7.1 按 NY/T 528 制备菌种，考察再生菌株和出发菌株菌丝长势、长速、抗杂菌能力等。 7.2 按 NY/T 2375 制作出菇菌棒，考察再生菌株和出发菌株发菌时间、满袋天数、抗病性等。 7.3 按 NY/T 2375 进行出菇试验，考察再生菌株和出发菌株农艺性状、品质、产量等；综合菌丝和子 实体生长与产量结果，筛选出恢复或超过出发菌株原有优良性状的再生菌株。 8 稳定性检测 8.1 8.2 按 NY/T 2375 进行生产栽培中试，进一步考察筛选的再生菌株优良性状稳定性。 选择表现稳定且优于当前主栽品种的再生菌株，用于生产。 3 DB1302/T 523—2020 参 [1] [2] 4 GB 19489-2008 实验室 GB 19172 平菇菌种 考 文 生物安全通用要求 献