ICS 65.150 B 52 DB51 四 川 省 地 方 标 准 DB51/T 2468—2018 裂腹鱼无乳链球菌病诊断技术规程 2018 - 04 - 18 发布 四川省质量技术监督局 2018 - 05 - 01 实施 发 布 1 DB51/T 2468—2018 目 次 前 言 ............................................................................... II 1 范围 .............................................................................. 1 2 规范性引用文件 .................................................................... 1 3 术语和定义 ........................................................................ 1 4 试剂和材料 ........................................................................ 1 5 设备和器械 ........................................................................ 2 6 临床检查 .......................................................................... 2 7 实验室样品采集 .................................................................... 2 8 细菌分离与纯化 .................................................................... 2 9 细菌鉴定 .......................................................................... 2 10 结果判定 ......................................................................... 5 11 综合判定 ......................................................................... 5 附录 A（规范性附录） 试 剂 配 方 .................................................. 6 附录 B（资料性附录） 无乳链球菌 cfb 基因参考序列（639 bp） ........................... 9 I DB51/T 2468—2018 前 言 本标准依据 GB/T 1.1-2009 给出的规定进行编写。 本标准中附录A为规范性附录、附录B为资料性附录。 本标准由四川省农业厅提出并归口。 本标准由四川省质量技术监督局批准。 本标准起草单位：四川农业大学、雅砻江水电凉山有限公司。 本标准起草人：耿毅、邓龙军、甘维熊、黄小丽、陈德芳、李亚军、张雨薇。 II DB51/T 2468—2018 裂腹鱼无乳链球菌病诊断技术规程 1 范围 本标准规定了裂腹鱼无乳链球菌病诊断的术语与定义、试剂和材料、设备和器械、临床检查、实验 室样品采集、细菌分离与纯化、细菌鉴定、结果判定和综合判定等技术规程。 本标准适用于齐口裂腹鱼(Schizothorax prenanti)、重口裂腹鱼（Schizothorax davidi）、短须 裂腹鱼（Schizothorax wangchiachii）、长丝裂腹鱼（Schizothorax dolichonema）和黄河裸裂尻鱼 （Schizopygopsis pylzovi Kesskr）无乳链球菌病的诊断。 2 规范性引用文件 下列文件对于文件的应用时必不可少的。凡是注日期的应用文件，仅注日期的版本适用于本文件。 凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 4789.28 食品卫生微生物学检测 染色法、培养基和试剂 GB/T 6682 分析实验室用水规格和实验方法 GB/T 18652 致病性嗜水气单胞菌检测方法 SC/T 7014 水生动物检疫实验技术规范 SC/T 7103 水生动物产地检疫采样技术规范 SC/T 7201.1 鱼类细菌病检疫技术规程 第1部分：通用技术 3 术语和定义 下列术语和定义适用于此文件。 3.1 裂腹鱼无乳链球菌病 指由无乳链球菌（Streptococcus agalactiae）感染引起的齐口裂腹鱼、重口裂腹鱼、短须裂腹鱼、 长丝裂腹鱼和黄河裸裂尻鱼等裂腹鱼类发病或死亡的一种细菌性疾病。 3.2 BHI Brain Heart Infusion 脑心浸液琼脂培养基 3.3 Cfb Complement Factor B 基因 补体因子B基因 4 试剂和材料 1 DB51/T 2468—2018 4.1 试剂、染色液与培养基 按 GB/T 4789.28、GB/T 18652 与 SC/T 7014 规定执行，Taq酶、dNTPs、Mix-reaction buffer、 DNA分子量标准参照物与核酸提取试剂盒选用专业试剂公司提供的商品化试剂，上述未提及的见附录A。 4.2 水 应符合 GB/T 6682 中一级水的规格。 4.3 引物 cfb基因PCR扩增引物，P2-F：5’- AAG TAC ATG CTG ATC AAG T -3’, P2-R：5’- TCT TGA TCA ACT TGT TGT AC -3’， - 20℃保存。 5 设备和器械 主要设备与器械如下： 解剖盘、剪刀、镊子、手术刀、培养皿、铂耳、酒精灯、普通光学显微镜、电子天平、高压灭菌锅、 恒温培养箱、超净工作台、普通冰箱、高速冷冻离心机、微量移液器、PCR扩增仪、离心管和PCR管、水 平电泳系统和凝胶成像系统等。 6 临床检查 6.1 临床症状 病鱼摄食减少，甚至停止摄食，反应迟钝，离群独游，或间隙性兴奋狂游与阵发性身体痉挛而变弯 曲。 6.2 外部检查 病鱼眼球单侧或双侧性突出，眼球周围充血、出血；下颌、鳃盖边缘、鳍条基部不同程度的充血、 出血；部分病鱼无明显外部病变而死亡。 6.3 剖检 胃肠道空虚，肠壁变薄，肠腔内有少量淡黄色的粘液；肝肿大充血，出血，呈斑驳状，质地变脆， 脾肿大，呈紫色；脑膜充血、出血；部分病鱼无明显的剖解变化。 7 实验室样品采集 样品采集按 SC/T 7103 执行。 8 细菌分离与纯化 在无菌的环境中，从病鱼的肝、肾或脑中直接取样常规划线接种BHI培养基（A.1），28℃培养36h-48h。 从中挑取表面光滑、微隆起、边缘整齐的乳白色圆形优势菌落划线接种BHI平板进行纯化培养。 9 细菌鉴定 2 DB51/T 2468—2018 9.1 革兰氏染色 按 GB/T 4789.28-2003 中2.2的规定执行。 9.2 生理生化试验 9.2.1 运动性试验 半固体琼脂按GB/T 4789.28中4.30的方法配制。把待检菌穿刺接种于半固体琼脂，28℃培养 36h-48h。若待检菌由穿刺线向四周扩散，其边缘呈云雾状，为运动性阳性；若待检菌只生长在穿刺线 上，边缘十分清晰，为运动性阴性。 9.2.2 吲哚试验 按 SC/T 7014 表2的吲哚（靛基质）试验的规定执行。培养基变红为阳性；不变红为阴性。 9.2.3 DNA 酶试验 将待检菌接种于DNA酶培养基平板（A.2）上，28℃培养48h。菌落周围培养基出现粉红色晕圈为阳 性；无晕圈为阴性。 9.2.4 氧化酶试验 以毛细管吸取四甲基对二苯胺的1％水溶液滴在细菌的菌落上。菌落呈玫瑰红色、深紫色为阳性； 不变色为阴性。 9.2.5 硫化氢（H2S）试验 按 GB/T 4789.28 中3.14的规定执行。培养基黑色为阳性、不变黑色为阴性。 9.2.6 甲基红（M·R）试验 按 SC/T 7014 表2的甲基红（M·R）试验的规定执行。培养基变红色为阳性；不变红色为阴性。 9.2.7 过氧化氢酶（接触酶）试验 按 SC/T 7014 表2的接触酶试验的规定执行。有气泡产生为阳性；无气泡产生为阴性。 9.2.8 酯酶（Tween 80）试验 将待检菌接种于酯酶（Tween 80）测定培养基平板（A.3），28℃培养7d在细菌生长的周围有模糊 晕圈为阳性；无模糊晕圈为阴性。 9.2.9 葡萄糖氧化发酵试验（O/F 试验） 按 GB/T 4789.28 中3.1的规定执行。若封口管与开口管的培养基均变黄为阳性，不变黄为阴性。 9.2.10 乙酰甲基甲醇（V-P）试验 按 SC/T 7014 表2的乙酰甲基甲醇（V-P）试验的规定执行。培养基下层出现红色为阳性，不出现 红色为阴性。 9.2.11 精氨酸双水解酶试验 3 DB51/T 2468—2018 将幼龄待检菌穿刺接种在精氨酸双水解酶培养基（A.4）上。28℃培养48h。菌落周围培养基出现粉 红色晕圈为阳性，无粉红色晕圈为阴性。 9.2.12 鸟氨酸脱羧酶试验 按 GB/T 4789.28 中3.12的规定执行。培养基呈紫色为阳性，对照管培养基为黄色。 9.3 cfb 基因 PCR 扩增与同源性分析 9.3.1 细菌基因组 DNA 提取 取2ml待检菌培养液，12000r/min离心1min，收集菌体。菌体悬浮于500μl TE缓冲液（pH8.0） （A.5）， 震荡悬浮，加入50μl 10％的SDS溶液（A.6），10μL 20mg/ml的蛋白酶K（A.7），混匀，37℃温育1h。 加入100μL 5mol/L的NaCl溶液（A.8），充分混匀，再加入100μL CTAB/NaCl溶液（A.9）混匀，65℃温 育20min。加入等体积的酚：氯仿：异戊醇（25﹕24﹕1）（A.10），混匀，12000r/min离心5min。取上 清液加入等体积的氯仿：异戊醇（24﹕1）（A.11），混匀，12000r/min离心5min。取上清液，加入1 倍体积异丙醇，颠倒混合，室温下静置10min，1