ICS 65.020.99 B 04 备案号： 湖 DB42 北 省 地 方 标 准 DB 42/T 1438—2018 甘薯品种真实性鉴定 ISSR 法 Verification of genuineness for sweetpotato—ISSR （报批稿） 2018 - 09 - 11 发布 2018 - 12 - 10 实施 湖北省质量技术监督局 发 布 DB42/T 1438—2018 目 次 前言 ............................................................................... III 1 范围 ............................................................................... 1 2 术语和定义 ......................................................................... 1 2.1 聚合酶链式反应 .................................................................. 1 2.2 简单重复序列区间 ................................................................ 1 2.3 引物 ............................................................................ 1 3 甘薯品种真实性鉴定 ................................................................. 1 3.1 DNA 提取 ...................................................................... 3.2 ISSR 扩增 ...................................................................... 3.2.1 反应体系 ................................................................... 3.2.2 反应程序 ................................................................... 3.3 PCR 产物的电泳检测 ............................................................. 3.4 数据记录 ....................................................................... 3.5 结果分析 ....................................................................... 1 1 2 2 2 2 2 附录 A（资料性附录） 引物清单 ........................................................ 3 附录 B（资料性附录） 湖北省主栽品种相应指纹图谱 ...................................... 4 I DB42/T 1438—2018 II DB42/T 1438—2018 前 言 本标准按照GB/T 1.1-2009《标准化工作导则 第1部分：标准的结构和编写》给出的规则起草。 本标准由湖北省农业科学院提出。 本标准由湖北省农业科学院归口管理。 本标准起草单位：湖北省农业科学院粮食作物研究所。 本标准主要起草人：杨新笋、王连军、雷剑、苏文瑾、柴沙沙、焦春海、宋峥。 III DB42/T 1438—2018 甘薯品种真实性鉴定 ISSR 法 1 范围 本标准规定了甘薯品种真实性鉴定 ISSR 法。 本标准适用于湖北省甘薯品种和种质真实性的鉴定，包括地方品种、选育品种、品系和国外引进种 质资源。 2 术语和定义 下列术语和定义适用于本标准。 2.1 聚合酶链式反应 polymerase chain reaction, PCR 是利用单链寡核苷酸引物对特异DNA片段进行体外快速扩增的一种方法。 2.2 简单重复序列区间 inter-simple sequence repeat, ISSR 是在 PCR 技术基础上发展起来的一种分子标记和检测方法，根据某个简单重复序列（微卫星位点） 设计出一系列特异引物，通过 PCR 反应扩增微卫星位点间隔的碱基序列，以检测其扩增片段长度的多 态性。 2.3 引物 primer 复制起始时为 DNA 聚合酶提供游离的 3’羟基作为复制起点的物质，体内 DNA 复制引物一般是 RNA，有时也可以 DNA 或者蛋白质替代；体外引物是一段 DNA。 3 甘薯品种真实性鉴定 3.1 DNA 提取 采用 SDS 法：取甘薯种薯幼苗新鲜幼嫩叶片 0.2g 于研钵中，加液氮速冻后立即研磨成粉末。转移 粉末至预冷的 1.5 mL 离心管中，加入 400μL 预热至 65℃的 SDS 提取缓冲液（含有 2%体积的 β-巯基乙 醇） 、100 μL 的 10% SDS，然后 65℃水浴 20 min，其间轻轻颠倒混匀数次。10000 rpm 离心 10 min。取 上清加入等体积的酚/氯仿/异戊醇（25:24:1） ，颠倒混匀，10000 rpm 离心 10 min。取上清加入 2 倍体积 的无水乙醇（-20℃预冷） ，颠倒混匀，-20℃放置 1 h。用带有弯钩的玻璃毛细管将絮状的 DNA 钩出来 放入 70%的乙醇中，洗涤 2 次，空气干燥 30 min。溶解在 100 μL 灭菌去离子水中，-20℃保存。 注：以上为推荐的 DNA 提取方法。其他能够达到 PCR 扩增质量要求的 DNA 提取方法都适用于本 标准。 3.2 ISSR 扩增 3.2.1 反应体系 1 DB42/T 1438—2018 模板DNA 1μL，引物2μL（10μM），10×Easy Taq Buffer，dNTPs 4μL（2.5mM），Taq DNA Polymerase 0.5μL，dd H2O补充体系至50μ L。引物清单见附录A。 3.2.2 反应程序 94 ℃变性5min；94 ℃变性30s，60 ℃复性1 min，72 ℃延伸2min，共40个循环；72℃延伸5min， 10℃保存。 3.3 PCR 产物的电泳检测 将适量的琼脂糖加入1×TAE缓冲液中，加热将其溶解，配制成琼脂糖浓度为1-3%的溶液，待冷却 至50℃-60℃，加入核酸染料，混匀，将其倒入制胶磨具，室温下凝固成凝胶后，放入TAE缓冲液中。 取PCR扩增产物和加样缓冲液按照5:1比例混匀，点样，其中一个泳道中加入DNA分子量标准品，接通 电源进行电泳。以5V/cm电压电泳，待溴酚蓝距凝胶前缘2cm左右停止电泳。 3.4 数据记录 电泳结束后，将琼脂糖凝胶置于凝胶成像仪上成像，保存待测品种与对照品种的电泳图谱。 3.5 结果分析 将待测品种与对照品种的电泳图谱结果相比较，若待测品种与对照品种有显著差别，可判定待测品 种与对照品种为不同品种，若待测品种与对照品种的PCR产物一致，可以增加引物，进行检测验证，必 要时可以增加其他方法佐证。湖北省主栽品种相应指纹图谱见附录B。 2 DB42/T 1438—2018 AA 附 录 A （资料性附录） 引物清单 表A.1所示了引物清单。 表A.1 引物清单 编号 HBAAS01 HBAAS02 HBAAS03 HBAAS04 HBAAS05 HBAAS06 HBAAS07 HBAAS08 HBAAS09 HBAAS10 HBAAS11 HBAAS12 HBAAS13 HBAAS14 HBAAS15 HBAAS16 序列 ACACACACACACACACG CTCTCTCTCTCTCTCTG ACACACACACACACACT AGAGAGAGAGAGAGAGT AGAGAGAGAGAGAGAGC AGAGAGAGAGAGAGAGG GAGAGAGAGAGAGAGAT GAGAGAGAGAGAGAGAC CACACACACACACACAA GTGTGTGTGTGTGTGTA AGAGAGAGAGAGAGAGYC GAGAGAGAGAGAGAGAYC GTGTGTGTGTGTGTGTYC ACACACACACACACACYG ACCACCACCACCACCACC ATGATGATGATGATGATG 退火温度 55 53 52.5 52 50 55 50 53 51.5 52.5 53.5 51.5 55 55 51.5 52 3 DB42/T 1438—2018 BB 附 录 B （资料性附录） 湖北省主栽品种相应指纹图谱 图 B.1 至图 B.3 分别所示了湖北省主栽品种用引物 HBAAS01、HBAAS02、HBAAS03 扩增的相应指纹谱。 图 B.1 所示了湖北省主栽品种用引物 HBAAS01 扩增的指纹图谱。 M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 M 2000 1000 750 500 250 2000 1000 750 500 250 100 100 说明： M.DNA Marker；1.广薯菜 2 号；2. 商薯 19；3. 尚志 12；4. 徐紫薯 1 号；5. 鲁薯 3 号；6. 徐薯 26；7. 徐薯 43-14； 8. 苏薯 10 号；9. 苏薯 3 号；10. 苏薯 11 号；11.徐薯 55-2；12. 徐紫 8008；13. 莆薯 53；14. 台农 71；15. 徐 22-5；16. 台农 66。 图 B.1 引物 HBAAS01 扩增结果 图 B.2 所示了湖北省主栽品种用引物 HBAAS02 扩增的指纹图谱。 M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 2000 1000 750 500 250 15 16 M 2000 1000 750 500 250 100 100 说明： M.DNA Marker；1.广薯菜 2 号；2. 商薯 19；3. 尚志 12；4. 徐紫薯 1 号；5. 鲁薯 3 号；6