ICS 65.020.20 CCS B 35 湖 DB43 南 省 地 方 标 准 DB43/T 1 9 36—2020 饲料中黄曲霉毒素B1快速检测 超导量点免疫荧光法 Detection of aflatoxin B 1 in feed Rapid quantitative method of superconducting dots immunofluorescence technique 2020-12-29发布 湖南省市场监督管理局 2021-03-29实施 发 布 DB43/T 1936—2020 目 次 前言························································································································ Ⅲ 1 范围 ····················································································································· 1 2 规范性引用文件 ······································································································ 1 3 原理 ····················································································································· 1 4 试剂与材料 ············································································································ 1 5 仪器与设备 ············································································································ 1 6 样品制备 ··············································································································· 2 7 上机测定 ··············································································································· 2 8 结果表述 ··············································································································· 2 9 重复性 ·················································································································· 2 附录 A（规范性） 超导量点免疫荧光快速定量检测卡性能评价要求 ······································ 3 I DB43/T 1936—2020 II DB43/T 1936—2020 前 言 本文件按照 GB/T 1.1—2020 给出的规则起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利，本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。 本文件由湖南省农业农村厅提出。 本文件由湖南省农业标准化技术委员会归口。 本文件起草单位：湖南省兽药饲料监察所、湖南九鼎科技（集团）有限公司、湖南省饲料工业协会。 本文件主要起草人：黄勇、李裕、李艳平、刘芬、张敏、雷加、周灿、曹霞。 III DB43/T 1936—2020 IV DB43/T 1936—2020 饲料中黄曲霉毒素 B1 快速检测 1 超导量点免疫荧光法 范围 本文件规定了饲料中黄曲霉毒素 B1 的超导量点免疫荧光测定方法的原理、试剂与材料、仪器与设 备、样品制备、上机测定与结果表述。 本文件适用于我省植物性饲料原料、配合饲料、浓缩饲料中黄曲霉毒素 B1 的快速检测。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本 文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB/T 14699.1 饲料 采样 GB/T 20195 动物饲料 试样的制备 3 原理 本方法基于超导量点标记的抗原抗体反应，采用荧光侧向免疫层析方法学原理。试样提取液中的黄 曲霉毒素 B1 与检测卡上标记的抗体相结合并发出荧光，荧光强度与试样中黄曲霉毒素 B1 含量相关。层 析结束后，用免疫荧光分析仪测定检测卡上的检测线和控制线的荧光强度，仪器根据内置标准曲线自动 算出试样中黄曲霉毒素 B1 的含量。 4 试剂与材料 4.1 除另有说明外，所用试剂均为分析纯，实验室用水应符合 GB/T 6682 中三级水的要求。 4.2 稀释缓冲液：由超导量点免疫荧光定量检测卡配套提供，或根据产品使用说明书配制。 4.3 提取液：量取 550mL 甲醇加入 450mL 水中，混匀。 5 仪器与设备 5.1 天平：感量 0.01g。 5.2 粉碎机：粉碎后全部通过 20 目分析筛。 5.3 离心机：转速≥4000 r/min。 5.4 涡旋振荡器。 5.5 检测卡：储存条件参照使用说明；技术指标应符合附录 A 要求。 5.6 免疫荧光分析仪：可测定并显示检测卡的测定结果。 1 DB43/T 1936—2020 5.7 滤纸：采用中速定量滤纸。 5.8 计时器。 6 样品制备 6.1 采样 按 GB/T 14699.1 的规定执行。 6.2 样品处理 6.2.1 试样制备按 GB/T 20195 的规定执行。用粉碎机（5.2）粉碎至全部通过 20 目分析筛。 6.2.2 称取 5 g（精确至 0.01 g）试样于 50 mL 离心管中，加入 25.0 mL 试样提取液（4.3） ，用涡旋 振荡器（5.4）振荡 10 min；静置后用滤纸（5.7）过滤，或取 1.0 mL～1.5 mL 混合液于离心管中，经 离心机（5.3）以 4000 r/min 离心 3～5 min。取滤液或离心后的上清液 100 μL 于另一洁净离心管中， 加入 400 μL 稀释缓冲液（4.2） ，充分混匀待测。 注：黄曲霉毒素 B1 超导量点免疫荧光定量检测卡所用的样品处理方法可能不同，应按照产品使用说明中规定的方法 进行操作。 7 上机测定 7.1 开启免疫荧光分析仪（5.6） 。 7.2 将检测卡（5.5）取出，加样孔朝上平放。 7.3 准确移取 75μL 待测液（6.2.2） ，加入检测卡加样孔中。 7.4 检测卡加样后，水平静置 15 min 反应（5.8） ，然后在 3 min 内（5.8）将检测卡插入免疫荧光分 析仪（5.6） ，仪器将自动进行检测。 7.5 结果读取 7.5.1 荧光分析仪（5.6）将在 13 秒内完成数据读取、分析，免疫荧光分析仪自动显示试样中黄曲霉 毒素 B1 的含量并保存检测结果。 7.5.2 异常结果处理 若免疫荧光分析仪的显示值>50 μg/kg，需移取 100 μL 滤液或上清液，加入 300 μL 试样提取 液（4.3） ，充分混匀后取 100 μL 至一洁净的离心管中，加入 400 μL 稀释缓冲液（4.2），充分混匀， 按照 7.2～7.5 进行测定。 注：免疫荧光分析仪的使用方法可能有所不同，应按照产品说明书的规定进行操作。 7.6 本方法检出限为 0.5μg/kg。 8 结果表述 试样中黄曲霉毒素 B1 的含量由免疫荧光分析仪自动计算并显示，单位为μg/kg。 9 重复性 在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不超过算术平均值的 20％。 2 DB43/T 1936—2020 附录 A （规范性） 超导量点免疫荧光快速定量检测卡性能评价要求 本附录规定了饲料中黄曲霉毒素 B1 超导量点免疫荧光快速定量检测卡的技术性能要求，用于对饲 料中黄曲霉毒素 B1 超导量点快速定量检测类产品的技术性能进行验证，以确保其适用于本方法。 A.1 准确性评价 采用 0 μg/kg、5 μg/kg、10 μg/kg 和 20 μg/kg 4 个浓度水平的黄曲霉毒素 B1 实物标准样品， 每个浓度平行测定不低于 6 次。计算检测卡检测结果与实物标准样品的相对偏差，4 个浓度的相对偏差 均应控制在-20％～+20％之间。 A.2 精密度评价 采用 10 μg/kg 黄曲霉毒素 B1 的实物标准样品，平行测定不低于 6 次，计算检测卡批内变异系数， 变异系数应≤20％。 A.3 批间稳定性评价 采用 10 μg/kg 黄曲霉毒素 B1 的实物标准样品，随机选取至少 6 个批次产品，每个批次产品测定 不低于 2 次，批内测定取其平均值，计算检测卡批间变异系数，变异系数应≤20％。 A.4 批内稳定性评价 采用 10 μg/kg 黄曲霉毒素 B1 的实物标准样品，随机选取 1 个批次产品测定，平行测定不低于 6 次，计算检测卡批内变异系数，变异系数应≤20％。 3